适用背景

单细胞转录组调控网络分析是单细胞转录组分析内容的高级分析之一，本文将介绍SCENIC/pySCENIC的流程，具体原理和内容不展开，主要展示代码复现流程。R的SCENIC基于AUCell，RcisTarget和GENIE3三个包进行分析，所以要先安装这些依赖包，而pySCENIC则已经封装好，直接用pip安装即可。只用SCENIC或pySCENIC也可以单独完成分析，但R语言运行起来很慢，pySCENIC可以有效提升分析速度，还用SCENIC是因为可视化用R语言会简单一些。

可视化部分请看这篇文章SCENIC/pySCENIC结果可视化 2022-11-08

快来看看三步完成单细胞数据调控网络流程分析和可视化!

---

运行环境准备

Python安装pyscenic

pip install scanpy -i https://mirrors.aliyun.com/pypi/simple/
pip install loompy -i https://mirrors.aliyun.com/pypi/simple/
pip install pyscenic -i https://mirrors.aliyun.com/pypi/simple/

R安装SCENIC

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("AUCell", "RcisTarget","GENIE3"))
if (!requireNamespace("devtools", quietly = TRUE)) install.packages("devtools")
devtools::install_github("aertslab/SCENIC")

---

代码实践

---

第一步，从Seurat对象中取子集并获取矩阵存为csv文件，并提取metadata信息。

此步骤的目的是存储表达矩阵和注释信息，为后面的分析生成输入文件。
get_count_from_seurat.R文件代码如下：

library(optparse)
op_list <- list(
make_option(c("-i", "--inrds"), type = "character", default = NULL, action = "store", help = "The input of Seurat RDS",metavar="rds"),
make_option(c("-d", "--ident"), type = "character", default = NULL, action = "store", help = "The sample Ident of Seurat object",metavar="idents"),
make_option(c("-s", "--size"),  type = "integer", default = 1000, action = "store", help = "The sample size of Seurat object",metavar="size"),
make_option(c("-l", "--label"), type = "character", default = "out", action = "store", help = "The label of output file",metavar="label")
)
parser <- OptionParser(option_list = op_list)
opt = parse_args(parser)

library(Seurat)
obj <- readRDS(opt$inrds)
if (is.null(opt$ident)) {
Idents(obj) <-  opt$ident
obj <- subset(x = obj, downsample = opt$size)
saveRDS(obj,"subset.rds")
}
if (is.null(opt$label)) {
label1 <- 'out'
}else{
label1 <- opt$label
}
write.csv(t(as.matrix(obj@assays$RNA@counts)),file = paste0(label1,'.csv'),quote=F)
write.table(obj@meta.data,'metadata_subset.xls',sep='\t',quote=F)

使用方法：
-i，输入Seurat对象的RDS文件
-d，随机取样分组的列名，例如groups，如果不赋值则表示不随机取样，使用全部细胞
-s，随机取样的大小，例如20，因为这里用的是pbmc_small，所以设置小一点，实际情况可能需要设置大一点
-l，输出文件的标签，默认为out。

Rscript get_count_from_seurat.R -i test.rds -d groups -s 20 -l out

运行后会生成3个文件：矩阵out.csv，metadata文件metadata_subset.xls和取子集后的RDS文件subset.rds（如果不取子集，这个文件不会生成）。

---

第二步，使用python导入csv文件后生成loom文件

此步骤是将表达矩阵转换为loom格式，因为pyscenic的输入为loom格式。
create_loom_file_from_scanpy.py 文件代码如下：

import argparse
import os, sys

import loompy as lp;
import numpy as np;
import scanpy as sc;
def main():
    parser= argparse.ArgumentParser(description='make input for pySCENIC')
    parser.add_argument('-i', '--input', type=str, required=True, metavar='input_csv')
    args = parser.parse_args()

    x=sc.read_csv(args.input)
    row_attrs = {"Gene": np.array(x.var_names),}
    col_attrs = {"CellID": np.array(x.obs_names)}
    name = args.input.split('.')[0]
    lp.create(name+'.loom',x.X.transpose(),row_attrs,col_attrs)

if __name__ == '__main__':
    main()

使用方法：
-i，传入的csv矩阵文件，例如第一步得到的out.csv

python create_loom_file_from_scanpy.py -i out.csv

运行后生成out.loom文件。

---

第三步，运行SCENIC的python版本，pyscenic

pyscenic的配置文件在官方提供的网站可以找到，需要三个文件：

• 1、TF列表文件：https://github.com/aertslab/pySCENIC/tree/master/resources
  或
  https://resources.aertslab.org/cistarget/tf_lists/
  人的列表文件：https://github.com/aertslab/pySCENIC/blob/master/resources/hs_hgnc_tfs.txt
• 2、数据库feather文件，需注意版本问题，一个是 pySCENIC < 0.12.0 和ctxcore < 0.2.0软件版本需要进到old文件夹，8月份最近的更新，另一个则是基因组版本，以及数据库来源的版本：
  https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/
  人的feather文件：
  https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/old/homo_sapiens/hg19/refseq_r45/mc9nr/gene_based/hg19-tss-centered-10kb-10species.mc9nr.feather
  
  

  cis Target databases
• 3、motif2tf数据库tbl文件：
  https://resources.aertslab.org/cistarget/motif2tf/
  人的文件：
  https://resources.aertslab.org/cistarget/motif2tf/motifs-v9-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl

以上文件选取仅供参考，实际情况可能需要选择不同文件。SCENIC的标准流程分为3步，第一步利用GENIE3构建转录因子与基因的调控网络，第二步利用RcisTarget验证转录因子与基因的调控网络的真实性，第三步计算AUC曲线筛选调控网络。

pyscenic_from_loom.sh文件代码如下：

#default value
input_loom=out.loom
n_workers=20
#help function
function usage() {
echo -e "OPTIONS:\n-i|--input_loom:\t input loom file"
echo -e "-n|--n_workers:\t working core number"
echo -e "-h|--help:\t Usage information"
exit 1
}
#get value
while getopts :i:n:h opt
do
    case "$opt" in
        i) input_loom="$OPTARG" ;;
        n) n_workers="$OPTARG" ;;
        h) usage ;;
        :) echo "This option -$OPTARG requires an argument."
           exit 1 ;;
        ?) echo "-$OPTARG is not an option"
           exit 2 ;;
    esac
done
#需要更改路径
tfs=hs_hgnc_tfs.txt
feather=hg19-tss-centered-10kb-7species.mc9nr.feather
tbl=motifs-v9-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl
pyscenic=/app/bin/pyscenic

# grn
$pyscenic grn \
--num_workers $n_workers \
--output grn.tsv \
--method grnboost2 \
$input_loom  $tfs

# cistarget
$pyscenic ctx \
grn.tsv $feather \
--annotations_fname $tbl \
--expression_mtx_fname $input_loom \
--mode "dask_multiprocessing" \
--output ctx.csv \
--num_workers $n_workers   \
--mask_dropouts

# AUCell
$pyscenic aucell \
$input_loom \
ctx.csv \
--output aucell.loom \
--num_workers $n_workers

使用方法：
-i，输入的loom文件，例如第二步生成的out.loom
-n，运行线程数，设置越大越快，根据实际情况设置

sh pyscenic_from_loom.sh -i out.loom -n 10

---

第四步，计算RSS

此步骤的作用是通过计算RSS值找到细胞类型的特异TF。
calcRSS_by_scenic.R文件代码如下：

library(optparse)
op_list <- list(
make_option(c("-l", "--input_loom"), type = "character", default = NULL, action = "store", help = "The input of aucell loom file",metavar="rds"),
make_option(c("-m", "--input_meta"), type = "character", default = NULL, action = "store", help = "The metadata of Seurat object",metavar="idents"),
make_option(c("-c", "--celltype"), type = "character", default = NULL, action = "store", help = "The colname of metadata to calculate RSS",metavar="lab
el")
)
parser <- OptionParser(option_list = op_list)
opt = parse_args(parser)

library(Seurat)
library(SCopeLoomR)
library(AUCell)
library(SCENIC)
library(dplyr)
library(KernSmooth)
library(RColorBrewer)
library(plotly)
library(BiocParallel)

loom <- open_loom(opt$input_loom)

regulons_incidMat <- get_regulons(loom, column.attr.name="Regulons")
regulons <- regulonsToGeneLists(regulons_incidMat)
regulonAUC <- get_regulons_AUC(loom,column.attr.name='RegulonsAUC')
regulonAucThresholds <- get_regulon_thresholds(loom)
close_loom(loom)

meta <- read.table(opt$input_meta,sep='\t',header=T,stringsAsFactor=F)

cellinfo <- meta[,c(opt$celltype,"nFeature_RNA","nCount_RNA")]
colnames(cellinfo)=c('celltype', 'nGene' ,'nUMI')
cellTypes <-  as.data.frame(subset(cellinfo,select = 'celltype'))
selectedResolution <- "celltype"

sub_regulonAUC <- regulonAUC
rss <- calcRSS(AUC=getAUC(sub_regulonAUC),
               cellAnnotation=cellTypes[colnames(sub_regulonAUC),
                                        selectedResolution])
rss=na.omit(rss)
try({
rssPlot <- plotRSS(rss)
save(regulonAUC,rssPlot,regulons,file='regulon_RSS.Rdata')
})

saveRDS(rss,paste0(celltype,"_rss.rds"))

使用示例：
-i，第三步得到aucell.loom文件
-m，第一步得到的metadata_subset.xls文件
-c，计算RSS的分组列

Rscript calcRSS_by_scenic.R -l aucell.loom -m metadata_subset.xls -c groups

运行后生成regulon_RSS.Rdata和groups_rss.rds文件

---

本文只展示了SCENIC/pySCENIC的常规分析流程，没有涉及可视化，下一篇打算介绍本文运行结果的可视化。