Comprehensive Analysis of the Prognosis andDrug Sensitivity of Differentiation-Related lncRNAs in Papillary Thyroid Cancer 

分化相关的lncRNAs在乳头状甲状腺癌中的预后和药物敏感性的综合分析。

发表期刊：Cancers (Basel)

发表日期：2022 Mar 7

影响因子：6+

doi: 10.3390/cancers14051353 

一、研究背景

        甲状腺癌（TC）的发病率近年来一直在增加，乳头状TC（PTC）是最常见的组织学类型，起源于滤泡细胞，占病例的85%。尽管绝大多数PTC患者通过合理的治疗如放射性碘（RAI）治疗预后良好，仍有大约10-20%的PTC患者在随访期间出现复发并转移。在这些患者中去分化是导致PTC转化为低分化或间变性TC（ATC）的主要原因。然而PTC去分化的潜在机制尚不清楚，目前的工作旨在识别一个有用的标志以指示去分化，并进一步探讨其在预后和化疗药物敏感性中的作用。

        最近越来越多的研究表明，遗传和表观遗传畸变、癌症干细胞、miRNA、免疫代谢网络和自噬在PTC脱分化和RAI抗性中起着关键作用。长非编码RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）被定义为一系列大于200个核苷酸的转录物，被认为是转录、转录后和翻译调节各个层面的关键调节因子。它们广泛参与TC患者的致癌作用、染色质动力学、与mRNA和蛋白质的相互作用、分化和胚胎发育。值得注意的是有研究证明，lncRNA可以有效调节NF-κB和PI3K-AKT信号通路，从而影响肿瘤发生。一些研究显示lncRNA是PTCs恶性甲状腺结节诊断、预后预测和治疗反应的潜在有用生物标志物。

二、材料和方法

1.数据来源

(1)TCGA：从UCSC Xena下载甲状腺癌RNA测序（RNA-seq）数据（FPKM值）共492个TC样本和58个正常样本。

(2)GEO数据库下载微阵列数据集GSE33630。由11个ATC、49个PTC和45个正常样本组成。该数据集基于GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列。

(3)2020年3月至2020年6月在湘雅医院甲状腺外科接受甲状腺切除术的患者中收集了20个配对PTC样本和相邻的正常组织。

2.实验流程

流程图

三、实验结果

1.DR-lncRNA调节因子的功能和相互作用

根据已发表的文献，共有16种与分化相关的调节因子，包括NKX2-1、DUOX1-2、pAX8、SLC5A5、SLC5A8、SLC26A4、FOXE1、TG、TSHR、THRA、THRB、DIO1-2、GLIS3和TPO。 PPI网络显示TSHR是一个中心基因，可以与其他15个基因相互作用 (图1A)，但Pearson相关分析显示TSHR与其他基因的相关性较弱。有趣的是，DOUX1和DOUX2具有最强的正相关(图1B)。

图1 DR-lncRNA调节因子之间相互作用及相关性

        分析492个TC样本和58个正常样本数据发现，PTC中大多数分化相关调节因子的表达显著较低，包括PAX8，SLC5A5，SLC5A8，SLC26A4，FOXE1，TG，TSHR，THRA，THRB，DIO1-2，GLIS3和TPO，只有NKX2-1在PTC组织中过表达(图S1A)。使用Pearson相关分析筛选DR lncRNA共发现116个DR lncRNAs。其中5个DR lncRNAs被证实与总生存率相关并显示出很强的预后价值，包括CAS15、LNC00900、AC055720-2、DPH6-DT和TNRC6C-AS1，图S1B显示CAS15和TNRC6C-AS1与分化相关调节因子呈负相关，而其他三种lncRNAs则呈正相关(图S1B)。所有DR lncRNAs在PTC中异常表达(图S1C)。

图S1 DR-lncRNA调节因子情况

2.风险评分与预后和肿瘤免疫微环境有关

        构建预后模型，根据以下公式计算每个PTC患者的风险分数：风险分数=(2.43×CAS15)+(−2.22×LNC00900)+(−0.87×AC055720.2) +(3.71×DPH6-DT)+(0.28×TNRC6C-AS1)。

        所有PTC患者基于风险评分中值被分为高风险和低风险两组。与高危亚组相比，低危组患者的生存时间更长(图2A)。图2B是患者生存状态和风险评分的分布。热图显示LNC00900、AC055720.2和TNRC6CAS1表达水平在低风险组显著上调(图2C)。风险得分的AUC为0.8742（图2D），表明预测性能良好。

图2  风险评分的预后价值

        关于PTC的免疫微环境，CIBERSORT分析显示：与低风险组相比，高风险组的嗜酸性粒细胞和活化的DC水平显著较高，而活化的肥大细胞（MC）、静止的MC和巨噬细胞M2水平较低（图S2A）。利用ssGSEA算法，发现低风险组中有大量的T卵泡辅助细胞、浆细胞样DC、未成熟DC和中央记忆CD8 T细胞（图S2B）。此外，MCP计数器进一步证实了免疫微环境与风险评分的关联，并显示低风险组的内皮细胞、中性粒细胞和CD8+T细胞的丰度明显较高（图S2C）。这些数据表明，风险评分模型可以预测预后，并与免疫细胞浸润密切相关。

图S2：风险特征与免疫细胞浸润之间的相关性。 **** p<0.0001, *** p<0.001, ** p<0.01, and * p<0.05

3.GO和KEGG富集分析

使用Metascape进行了GO和KEGG通路富集分析。前九个GO术语是甲状腺激素生成、甲状腺激素代谢过程、激素代谢过程、含胶原的细胞外基质、顶端质膜、基底外侧质膜、糖胺聚糖结合、丝氨酸型内肽酶活性和肝素结合（图3A-C）。KEGG分析表明，细胞粘附分子（CAM）、ECM-受体相互作用、色氨酸代谢、糖胺聚糖生物合成和硫酸可拉坦与PTC的形成密切相关（图3D）

图3 功能和通路富集分析结果

4.药物敏感性分析

作者采用了spearman相关分析，以评估药物敏感性和分化相关调节因子之间的相关性。图4A显示了统计差异最大的前8种药物。结果显示：高风险组相比，低风险组对苯达莫司汀和TAS-6417在针对分化相关调节因子方面更敏感（图4B）。图S4显示了药物的结构，这些发现突出表明该模型可被视为潜在的化疗敏感性预测因子。

图4 药物敏感性和分化相关调节因子之间的相关性

图s4 药物结构模型

5.DR-lncRNAs预后诺模图的构建

单变量分析显示PTC患者的风险评分、M1期、T4期、TNM III-IV期和年龄与总体生存率（OS）显著相关。进一步的多变量分析显示，风险评分和年龄是独立的预后因素。随后，构建了OS预测的综合诺模图（图5A）。3年期和5年期OS的AUC分别为0.966和0.967（图5B）。此外综合诺模图模型在预测3年和5年的OS方面表现出色（图5C）。DCA曲线显示，综合诺模图可以更好地预测OS，并且比年龄或风险评分具有更有利的临床适用性（图5D）。

图5  综合诺模图的构建和评估

6.DR-lncRNA表达的验证

为了验证DR lncRNAs的表达水平，作者选择GSE33630数据库在TC和正常组织之间进行差异分析。结果表明，与ATC和正常组织相比，PTC组织中LNC00900、AC055720-2和TNRC6C-AS1表达上调。随着分化程度的增加，DPH6-DT的表达水平显著上调，然而CASC15的表达水平则与分化程度呈负相关（图6A），ATC患者的风险评分最高（图6B）。TNRC6C-AS1和CAS15的表达显著高于正常组织和细胞系（p<0.001），而DPH6-DT在TC组织（图S6A）和细胞系（图S6B）中的表达显著低于正常组织和细胞系。图S6C显示，只有DPH6-DT与分化水平相关。TNRC6C-AS1和CASC15已经在PTC中进行了研究，因此，作者选择DPH6-DT进行进一步的实验。

图6 预后相关DR lncRNAs表达及风险评分与分化程度的关系

图S6 预后相关DR lncRNAs的差异表达

7.DPH6-DT的下调通过激活PI3K-AKT信号通路促进细胞增殖和转移

为了探索DPH6-DT在TC中的生物学功能，作者通过转染三种siRNA将DPH6-DT敲除。其中，DPH6-DT-siRNA3有效地抑制了DPH6-DT的表达（图7A）。CCK-8分析表明，沉默DPH6-DT可显著提高细胞活力（图7B），EdU分析表明，DPH-6DT缺乏可显著增加IHH-4和KTC-1细胞中PTC细胞的增殖（图7C）。同样，当DPH6-DT沉默时，入侵和迁移增强（图7D）。此外，作者还探究了PTC中DPH6-DT-敲除的潜在机制变化。Western blot分析显示，缺失DPH6-DT可增加IHH-4和KTC-1细胞中AKT、p-AKT和PI3K的表达水平。然而，在ERK和p-ERK中没有观察到差异。此外，DPH6-DT下调还增加了上皮-间质转化（EMT）过程中波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达。这些数据表明，DPH6-DT的敲除导致PTC中PI3K/AKT信号通路的激活。

图7  DHP6-DT的缺失激活PI3K-AKT信号通路以促进细胞增殖和转移

四、结论

        本研究系统地描述了DR-lncRNAs调节因子的表达模式、肿瘤免疫微环境、药物敏感性和预后价值，揭示了其在PTC患者预后和免疫细胞浸润中起着至关重要的作用，并且是药物化学敏感性的预测因子。研究表明，与正常组织相比，TC组织中DPH6-DT的表达显著降低，分化相关调节因子的大部分表达也显著降低。同时，作者证了DPH6-DT的表达水平与TC分化程度显著相关。更重要的是证实DPH6-DT可以被视为一种新的信号，通过激活PI3K-AKT信号通路来指导分化和促进TC发展，这为APT和RAI难治性TC患者的早期诊断和治疗提供了重要的依据，以改善其不良的临床预后。