前言

  染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)，一个科研界的新起之秀，随着国际学术期刊《Nature》^[1] 和《Cell》^[2] 相继发文后，迅速引起研究人员的重视。eccDNA从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。随着对eccDNA分子的研究，目前对eccDNA的功能有一定的认识，未来还会有新的发现。2018年，发表于《Trends in Genetics》^[3] 一篇综述根据近些年的研究总结了eccDNA的主要功能，如下图所示：

Circle-Map

  通过前人的研究可以看出eccDNA在生理或者病理过程中还是很重要的，既然这么重要，那么该如何鉴定呢？下面我们就回到今天的主题，来看看如何鉴定eccDNA。目前，市面上有一些鉴定软件，例如：Circle-Map^[4]、ECCsplorer^[5]、Circle_finder等，而我们今天要说的主角就是Circle-Map，该软件由python3编写，安装和使用都很方便，并且生成的结果也很简洁明了。

1. 软件安装
     可以直接使用pip命令直接安装，完成后即可在命令行使用Circle-Map命令，该软件包含以下五个子命令ReadExtractor、Realign、bam2bam、Repeats、Simulate，鉴定eccDNA主要使用前两个命令即可。

pip install Circle-Map

2. index准备
     Circle-Map的输入文件是bwa生成的bam，在使用bwa比对前需要构建index，以及后续步骤会使用到参考基因组的fasta，需要用samtools对fasta建index:

bwa index hg38.fa
samtools faidx hg38.fa

3. mapping
   使用bwa将数据比对到参考基因组上：

bwa mem -q hg38 sample.R1.fastq.gz sample.R2.fastq.gz | samtools view -bS -o sample.raw.bam

4. sort
   分别准备 reads name 和 chromosome coordinate排序的bam，并对bam建index：

samtools sort -n -o sample.qname.bam sample.raw.sam
#samtools index sample.qname.bam
samtools sort -o sample.sort.bam sample.raw.sam
samtools index sample.sort.bam

5. ReadExtractor
   接着，使用上一步生成的按reads name排序的bam作为输入，生成包含候选reads的bam，并对生成的bam按chromosome coordinate排序和建立index：

Circle-Map ReadExtractor -i sample.qname.bam -o sample.candidates.bam
samtools sort -o sample.candidates.sort.bam sample.candidates.bam
samtools index sample.candidates.sort.bam

这一步应该会出现类似下面的提示：

[E::idx_find_and_load] Could not retrieve index file for 'sample.qname.bam'
Processed 25000000 reads in 2.764 mins
finished extracting reads. Elapsed time: 2.842184130350749 mins
Thanks for using Circle-Map

  可以看到程序还是运行成功了，这个提示可以选择忽略，至于出现Could not retrieve index提示的原因也很明确，就是没有对bam建索引。那么，既然知道了原因为啥不解决呢？这是因为samtools只能对chromosome coordinate排序的bam建索引，而这里用的是reads name排序的bam，所以还是直接选择忽略这个提示吧！

6. Realign
   最后，使用前面生成的sample.candidates.sort.bam、sample.qname.bam、sample.sort.bam三个bam文件以及参考基因组的fasta文件作为输入，使用Realign来鉴定eccDNA：

Circle-Map Realign -i sample.candidates.sort.bam -qbam sample.qname.bam -sbam sample.sort.bam -fasta hg38.fa -o sample.circle.bed

  当程序正常运行结束后，会生成bed格式的文件sample.circle.bed，内容如下：

chr7    143911105       143917553       12      7       251.0   29.97115384615385       5.408852146902424       1.0  0.9988734509951184       0.0

注意事项

  Circle-Map使用过程还是很简单的，但是使用的时候还是有一些需要注意的点。重点来了！重点来了！重点来了！这个软件(version=1.1.4)有些小bug，如ReadExtractor命令的输入和输出文件不能带有路径，否则程序会运行出错。这个问题的原因是该软件会自动获取当前的工作路径，然后会将这个路径和输入拼接起来，这样的话，如果你的输入文件不在当前目录就会出现找不到输入文件的错误。那么，想要正常运行：一是在输入文件的目录下运行，二是修改一下源码，可以到模块目录下找到extract_circle_SV_reads.py文件，将raw_bam = ps.AlignmentFile(self.working_dir + "/" + self.sorted_bam, "rb")替换为ps.AlignmentFile(self.sorted_bam, "rb")即可。还有一个需要注意的参数-dir，这个参数的意义是切换工作路径，如果想要指定输出目录可以用这个参数，不要在输出文件名里面加路径！因为软件也会自动把工作路径和输出文件名拼接起来。不知道出于什么原因，作者要这么设计程序，使用起来感觉怪怪的！
  Realign使用起来也有同样的注意事项，输出跟ReadExtractor完全一样，而输入只有-sbam参数的输入bam不能带路径，简单点的解决方法跟上面第一点，在bam文件所在目录运行，二是修改模块文件Coverage.py里面的代码，将self.bam = ps.AlignmentFile(directory + "/" + sorted_bam, "rb")替换为self.bam = ps.AlignmentFile(sorted_bam, "rb")。

结束语

  鉴定eccDNA的软件还有其他的选择，比如前面提到的另外两款软件ECCsplorer、Circle_finder，对于Circle_finder本人并没有接触过，这里就不再赘述。不过，ECCsplorer是本人一开始打算使用的软件，因为这款软件比较新，而且从文章的结果来看比Circle-Map有优势，并且这个软件的分析内容也较丰富一些，还有就是能生成可视化的网页报告。看完文章的介绍就心动了，确定要用这款软件。让人没有想到的是该软件安装起来就挺费劲，虽然介绍说支持conda安装，但是用conda安装一晚上没有啥动静。那只能放弃自动安装，选择手动安装，从安装到能正常使用，过程着实有些不易！最终还是成功安装了，并且用软件自带的数据也成功运行了。本以为可以顺利地分析的数据了，但程序运行过程中还是错误了，有因为内存不足中断的，有卡死的，现场可谓凄凄惨惨戚戚！咱用的服务器集群不算差啊，单个节点24cpu200G内存。可见这款软件对资源要求确实很高，这一点作者倒没有遮掩，在文章末尾也提到了这个局限性。所以，ECCsplorer没有优化版本前，最好还是不要尝试了，反正本人选择放弃使用了！毕竟，做分析选一款好用的工具可以提高不少的效率啊！

参考资料

1. 《Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression》 ↩

2. 《Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications》 ↩

3. Discoveries of Extrachromosomal Circles of DNA in Normal and Tumor Cells ↩

4. https://github.com/iprada/Circle-Map/wiki/Tutorial:-Identification-of-circular-DNA-using-Circle-Map-Realign ↩

5. ECCsplorer: a pipeline to detect extrachromosomal circular DNA (eccDNA) from next‑generation sequencing data ↩