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单细胞测序之差异表达基因获得方法

吹不散的烽烟 2023-03-28 原文

1.加载数据

library(Seurat)
library(SeuratData)
pbmc <- LoadData("pbmc3k", type = "pbmc3k.final")
> pbmc
An object of class Seurat 
13714 features across 2638 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (13714 features, 2000 variable features)
 2 dimensional reductions calculated: pca, umap

2.执行默认的差异表达测试

Seurat 的大部分差异表达特征可以通过“FindMarkers()”函数访问。 默认情况下，Seurat 基于非参数 Wilcoxon 秩和检验执行差分表达式。 这取代了以前的默认测试（'bimod'）。 要测试两组特定细胞之间的差异表达，请指定“ident.1”和“ident.2”参数。

# list options for groups to perform differential expression on
> levels(pbmc)
[1] "Naive CD4 T"  "Memory CD4 T" "CD14+ Mono"   "B"            "CD8 T"       
[6] "FCGR3A+ Mono" "NK"           "DC"           "Platelet" 
# Find differentially expressed features between CD14+ and FCGR3A+ Monocytes
>monocyte.de.markers  <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono")
|++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++| 100% elapsed=04s 
# view results
> head(monocyte.de.markers)
               p_val avg_log2FC pct.1 pct.2    p_val_adj
FCGR3A 1.193617e-101  -3.776553 0.131 0.975 1.636926e-97
LYZ     8.134552e-75   2.614275 1.000 0.988 1.115572e-70
RHOC    4.479768e-68  -2.325013 0.162 0.864 6.143554e-64
S100A8  7.471811e-65   3.766437 0.975 0.500 1.024684e-60
S100A9  1.318422e-64   3.299060 0.996 0.870 1.808084e-60
IFITM2  4.821669e-64  -2.085807 0.677 1.000 6.612437e-60

查找 CD14+ 单核细胞与所有其他细胞之间的差异表达特征

monocyte.de.markers  <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = NULL, only.pos = TRUE)
head(monocyte.de.markers)

3.预过滤基因或细胞以提高 DE 的速度

为了提高差异基因发现的速度，特别是对于大型数据集，Seurat 允许对基因或细胞进行预过滤。 例如，在任一组细胞中很少检测到的特征基因，或者以相似的平均水平表达的特征，不太可能被差异表达。 min.pct、logfc.threshold、min.diff.pct 和 max.cells.per.ident 参数的示例用例如下所示。

head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", min.pct = 0.5))
head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", logfc.threshold = log(2)))
head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", min.diff.pct = 0.25))
head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", max.cells.per.ident = 200))

4.使用替代统计方法执行 DE 分析 (中文翻译可能不准)

  • "wilcox"：Wilcoxon 秩和检验（默认）
  • "bimod"：单细胞特征表达的似然比检验
  • "roc" : 标准 AUC 分类器
  • "t" : 学生 t 检验
  • “泊松”：假设潜在负二项分布的似然比检验。仅用于基于 UMI 的数据集
  • “negbinom”：假设潜在负二项分布的似然比检验。仅用于基于 UMI 的数据集
  • “LR”：使用逻辑回归框架来确定差异表达的基因。构建基于每个特征单独预测组成员的逻辑回归模型，并将其与具有似然比检验的空模型进行比较。
  • “MAST”：将细胞检测率视为协变量的 GLM 框架
  • “DESeq2”：DE 基于使用负二项分布的模型
# necessary to get MAST to work properly
library(SingleCellExperiment)

head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", test.use = "MAST"))
head(FindMarkers(pbmc, ident.1 = "CD14+ Mono", ident.2 = "FCGR3A+ Mono", test.use = "DESeq2", max.cells.per.ident = 50))
单细胞基因identcodeMono

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