RNA-seq入门实战整体分析流程

前言：
进行RNA-seq入门实战首先需要有一定的linux与R基础，推荐跟着B站生信技能树-jimmy老师学习打牢基础：
【生信技能树】生信人应该这样学linux(更新至第14集)_哔哩哔哩_bilibili
【生信技能树】生信人应该这样学R语言_哔哩哔哩_bilibili

本节概览：

1. Linux下RNA-seq环境创建:
   Ubuntu子系统下载安装、Mniconda3与上游分析软件下载
2. R下RNA-seq环境创建
   R与Rstudio下载安装、Bioconductor与R包下载

1. Linux环境设置

1.1 Linux系统的创建——Ubuntu

运行Linux系统一般使用服务器或者个人电脑的虚拟机（Virtualbox、VMware）和子系统，下面简单介绍Windows子系统的安装配置，
详细说明请参阅Windows子系统WSL的体验与配置——Ubuntu-22.04

• Ubuntu子系统的下载安装
  首先在win10中搜索“ 启用或关闭Windows功能 ”，进入该程序，勾选“适用于Linux的Windows子系统”；之后去微软商店搜索Ubuntu下载安装，一般安装默认版本或者最新的22.04LTS

  
  
  
  
  
  
• 用户权限设置
  设置好用户名和密码进入Ubuntu后，需要设置一下用户权限
  启用root需要设置密码：sudo passwd root
  添加用户至root组： usermod -aG sudo username
  切换root用户：su
  退出root：exit
• 软件镜像源设置
  一般选择国内的清华镜像，ubuntu | 镜像站使用帮助 | 清华大学开源软件镜像站 | Tsinghua Open Source Mirror，Ubuntu 的软件源配置文件是 /etc/apt/sources.list。将系统自带的该文件做个备份，再编辑（* 注意要先切换为root用户*才能编辑该文件）

su
cd /etc/apt/
cp sources.list sources.list.bak
vim sources.list

Ubuntu版本 22.04 LTS的设置（注意要找到对应的Ubuntu版本设置）如下：

# 默认注释了源码镜像以提高 apt update 速度，如有需要可自行取消注释
deb https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy main restricted universe multiverse
# deb-src https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy main restricted universe multiverse
deb https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-updates main restricted universe multiverse
# deb-src https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-updates main restricted universe multiverse
deb https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-backports main restricted universe multiverse
# deb-src https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-backports main restricted universe multiverse
deb https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-security main restricted universe multiverse
# deb-src https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-security main restricted universe multiverse
# 预发布软件源，不建议启用
# deb https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-proposed main restricted universe multiverse
# deb-src https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/ubuntu/ jammy-proposed main restricted universe multiverse

• 更新一下所有软件

sudo  apt update       #更新可用软件包列表
sudo  apt upgrade      #更新已安装的包

1.2 Mniconda3下载安装

一般使用Mniconda3软件进行创建分析环境和管理软件，下面简单介绍Mniconda3的安装，其详细使用说明请参阅Miniconda3的安装、配置和使用

• 下载与安装
  切换到安装位置（一般为主目录~）， 下载最新的miniconda3，bash启动安装，一直enter、yes就可以了。

wget https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
#wget -c https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
bash  Miniconda-latest-Linux-x86_64.sh

• 设置conda软件镜像源
  依次输入以下命令设置软件镜像源，并展示镜像源地址，这里设置了中科大镜像：

conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/pro
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/r
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/main
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config  --set show_channel_urls yes

• 创建分析环境
  创建rna流程环境rna_p3，指定python版本为3，同时下载sra-tools 软件，之后每次要运行rna流程都要进入该环境

conda create -n rna_p3 python=3 sra-tools               
conda env list                                         #查看环境
conda activate rna_p3                                  #进入conda 环境
conda deactivate                                    #退出当前conda环境

• 上游分析软件下载
  本次RNA-seq流程涉及软件如下所示，使用conda install -y 软件名=版本号依次进行下载即可，可同时下载多个软件，但不建议同时下载太多，容易报错

质控清洗：fastqc multiqc trim-galore
比对计数： hisat2 subread samtools=1.6 salmon

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2. R环境设置

注意，安装使用R首先需要你的电脑用户名不能含有中文，否则后期运行程序会很容易报错，如果用户名含有中文请进行更改（很难。。。）或新建一个用户；
Rstudio是R的编译器，能提升用户交互体验，安装Rstudio前一定要先安装R

2.1 R与Rstudio下载安装

• 先在清华镜像源下载 R，地址：The Comprehensive R Archive Network (tsinghua.edu.cn)，
  依次进入：Download R for Windows——base——Previous releases；
  一般选择下载R 4.1.3，使用最新版可能会有不适配的问题，使用默认选项一直确定安装即可
  

  

• 安装好 R后之后，再去Rstudio官网下载Rstudio，地址：Download the RStudio IDE - RStudio
  

  

• Rstudio中设置清华镜像源
  依次进入：Tools——Global Options——Pakages——Change；选择镜像源

  
  
  

2.2 Bioconductor与R包下载

新建一个Rscript，运行以下内容，下载Bioconductor和本次实战所需所有R包等，代码修改自jimmy老师

###Bioconductor 下载
install.packages("BiocManager") 

###设置好清华镜像
rm(list = ls())   
options()$repos 
options()$BioC_mirror
#options(BioC_mirror="https://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/") 
options(BioC_mirror="http://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/bioconductor/")
options("repos" = c(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))
options()$repos 
options()$BioC_mirror

###安装需要的包
BiocManager::install(c("GSEABase","GSVA","msigdbr","clusterProfiler" ),ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("GEOquery","limma","impute" ),ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("org.Hs.eg.db","org.Mm.eg.db"),ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("DESeq2","edgeR" ),ask = F,update = F)
BiocManager::install("enrichplot",ask = F,update = F)
BiocManager::install("devtools",ask = F,update = F)
BiocManager::install("WGCNA",ask = F,update = F) 
BiocManager::install("data.table",ask = F,update = F)
BiocManager::install("tximport",ask = F,update = F)
BiocManager::install("tidyverse",ask = F,update = F)
BiocManager::install("DOSE",ask = F,update = F)
BiocManager::install("patchwork",ask = F,update = F)
BiocManager::install("RBGL",ask = F,update = F)  #Vennerable依赖包
BiocManager::install("pathview",ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("STRINGdb","ggraph","igraph"),ask = F,update = F)
install.packages("Vennerable", repos="http://R-Forge.R-project.org") #安装Vennerable包
install.packages("statmod")

#其他一些基础包安装
options()$repos 
install.packages(c("FactoMineR", "factoextra")) 
install.packages(c("ggplot2", "pheatmap","ggpubr","ggthemes","ggstatsplot","ggsci","ggsignif")) 
install.packages("rvcheck")
(.packages())  #查看当前加载运行包

#更新所有包
rvcheck::update_all(check_R = F,
                    which = c("CRAN", "BioC", "github"))

• 永久设置bioconductor镜像

#bioconductor | 镜像站使用帮助 | 清华大学开源软件镜像站 | Tsinghua Open Source Mirror
file.edit('~/.Rprofile')

输入以下内容：

# 清华源的镜像
options(BioC_mirror="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/bioconductor")

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以上就是进行RNA-seq流程前的全部准备了，下一步就可以开始进行上游数据下载、格式转化和质控清洗等步骤啦

参考资料
GitHub - jmzeng1314/GEO （强烈推荐学习）
【生信技能树】生信人应该这样安装软件_哔哩哔哩_bilibili
【生信技能树】生信分析入门环境搭建_哔哩哔哩_bilibili

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RNA-seq实战系列文章：
RNA-seq入门实战（零）：RNA-seq流程前的准备——Linux与R的环境创建
RNA-seq入门实战（一）：上游数据下载、格式转化和质控清洗
RNA-seq入门实战（二）：上游数据的比对计数——Hisat2+ featureCounts 与 Salmon
RNA-seq入门实战（三）：从featureCounts与Salmon输出文件获取counts矩阵
RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查
RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较
RNA-seq入门实战（六）：GO、KEGG富集分析与enrichplot超全可视化攻略
RNA-seq入门实战（七）：GSEA——基因集富集分析
RNA-seq入门实战（八）：GSVA——基因集变异分析
RNA-seq入门实战（九）：PPI蛋白互作网络构建（上）——STRING数据库的使用
RNA-seq入门实战（十）：PPI蛋白互作网络构建（下）——Cytoscape软件的使用
RNA-seq入门实战（十一）：WGCNA加权基因共表达网络分析——关联基因模块与表型